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蛋白质末端的测定_病毒生物实验

时间:2020-02-09百科知识联系我们
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实验二十二 蛋白质N末端的测定

一、实验目的

掌握二甲氨基萘磺酰氯与蛋白质或氨基酸结合的条件;了解氨基酸衍生物在聚酰胺薄膜上获得分离的原理和操作;掌握蛋白质N末端氨基酸的测定方法。

二、实验原理

蛋白质或多肽的DNS标记:荧光试剂二甲氨基萘磺酰氯(dansyl-Cl简称DNS-Cl)与蛋白质或多肽的N-末端游离氨基结合,生成带有荧光的DNS-蛋白质或DNS-肽。这些衍生物很稳定,在6mol/L盐酸中110℃水解12min,多彩贵州网除少数DNS-氨基酸有部分破坏外,大部分DNS-氨基酸几乎不多彩贵州网破坏,再经过有机溶剂反复抽提,可得到较纯的DNS-N末端氨基酸。

层析:聚酰胺薄膜上含有大量的酰胺基团,这些基团能与DNS-氨基酸上的羧基形成氢键而产生吸附作用。由于不同的氨基酸有结构上的差异,因此形成氢键的强弱就决定了吸附力的大小。在层析中,又因展层剂与被分离物在聚酰胺表面竞争形成氢键,使DNS-氨基酸在膜表面产生吸附、解吸附的连续过程,达到彼此分离。将胰岛素N-末端的DNS-氨基酸Rf值与标准氨基酸的DNS-衍生物(DNS-氨基酸)的Rf值作对照比较,就可确定胰岛素N-末端的氨基酸为何种氨基酸。

三、实验材料及器材

1.试剂

(1)甘氨酸、苯丙氨酸(层析纯)用0.2mol/L NaHCO3配成浓度为1.5mg/ml的溶液。

(2)胰岛素(层析纯)用0.2mol/L NaHCO3配成浓度为2.5mg/ml的溶液。

(3)DNS-Cl丙酮液(2.5mg/ml)、重蒸6mol/L盐酸(分析纯)、0.2mol/L碳酸氢钠溶液(优级纯)、苯(分析纯)、乙酸乙酯(分析纯)、冰乙酸、甲酸(88%分析纯)、重蒸1mol/L盐酸(分析纯)。

2.器材

(1)聚酰胺薄膜。

(2)小钟罩(用7 cm×10cm的次品级离心管代替)、玻璃小指管(0.5cm×8cm)、紫外层析灯、超级恒温水浴锅、玻璃真空干燥器、自动控制加热干燥器、电吹风、电炉、酒精喷灯、毛细管、长滴管、培养皿(直径6cm)、表面蒸发皿(直径5~6cm)。

四、实验操作方法

1.标准氨基酸的DNS化

(1)用0.2mol/L NaHCO3液配制甘氨酸和苯丙氨酸溶液,其浓度为1.5mg/ml,然后各取0.1ml于小试管中,并加入DNS-Cl丙酮液0.1ml,用胶布封住小试管。

(2)摇匀,在40℃水浴里,保温2h。

(3)置玻璃干燥器里,60℃真空干燥,除去丙酮。

(4)加1~2滴水,用1mol/L HCl调pH值至2~2.5。

(5)加约0.3ml乙酸乙酯,摇匀,待分层后,吸取上层的乙酸乙酯,这样反复抽取3~4次。

(6)收集合并的乙酸乙酯提取液(如果里面带有水,摇动一下,就会在试管试壁上出现很小的水珠),然后真空干燥,蒸去乙酸乙酯。(www.anred.net.cn)

(7)层析时,可加少量丙酮(1~3滴溶液,便可点样)。

2.DNS-蛋白质的制备

(1)用0.2mol/L NaHCO3溶液将欲检测的蛋白质配成2.5mg/ml。然后取0.2ml加入小试管,加0.2ml DNS-Cl丙酮液,摇匀,胶布封口。

(2)置40℃的水浴锅中,保温2h。

(3)在60℃真空干燥,除去丙酮,剩余的固体为DNS-蛋白质。

(4)加6mol/L HCl 0.2ml溶解,用细长滴管将样品转移到(0.5cm×8cm)的玻璃小指管中,在酒精喷灯上封口。

(5)在108℃的烘箱里水解过夜(12h),水解出来的液体应是无色或稍带黄色。

(6)将指管口打开后,把水解液倒在表面皿上,在电炉上微微蒸干,再加0.1ml水,约用半滴1mol/L HCl调pH 2~2.5。

(7)用0.6~1.2ml乙酸乙酯分三次抽提,然后将合并液转移到小试管中。

(8)在60℃真空干燥,除去乙酸乙酯,层析前加1~2滴丙酮,便可点样。

3.DNS-氨基酸的层析

在聚酰胺薄膜(7×7)的左下角距两边1cm处画一点(C点),在距C点1cm,距左边2cm,距下边1cm处画一点(A点),在左上角距左边2cm,距上边1cm处画一点(B点)(图22-1所示)。

在A点处用毛细管点上样品DNS-末端氨基酸,在B点处点上DNS-Gly,其样品直径2~3mm,在溶剂系统Ι中进行第多彩贵州网一向展层,直到溶剂前沿距顶1cm,取出聚酰胺薄膜,吹干,在C点处点上DNS-Phe,将聚酰胺薄膜转90°角,在第二种溶剂系统中进行第二向展层,直到溶剂前沿距顶0.5cm,取出聚酰胺薄膜,吹干。

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图22-1

将聚酰胺薄膜置于254nm或265nm的紫外灯下观察,将绿色的荧光点画好,将样品胰岛素的N-末端胰岛素与标准DNS-Gly、DNS-Phe的层析位置相比较,即可证明突变蛋白质的N-末端氨基酸是Gly及Phe。

展层剂系统:

第一相 苯:冰醋酸(9∶1V/V)

第二相 甲酸∶水(1.5∶100V/V)

第一相展层剂易挥发,临层析前再配,并要充分混匀。

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