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实验十二血凝素基因的原核表达_病毒生物实验

时间:2020-02-09百科知识联系我们
实验十二血凝素基因的原核表达_病毒生物实验

实验十二血凝素基因的原核表达

一、实验目的

掌握原核表达蛋白的方法。

二、实验原理

E.coli是重要的原核表达体系。在重组基因转化入E.coli菌株以后,通过温度或者诱导物等的诱导,诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质。提高外源基因表达水平的基本手段之一,就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段,以减轻宿主菌的负荷。

本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔(IPTG)诱导外源基因表达。

不同的表达质粒表达方法并不完全相同,因启动子不同,诱导表达要根据具体情况而定。诱导表达后可通过SDS-PAGE电泳来检测表达蛋白质。

细菌裂解的常用方法有:①高温珠磨法;②高压匀浆;③超声破碎法;④酶溶法;⑤化学渗透等。前三种方法属机械破碎法,并且方法①、②已在工业生产中得到应用,后三种方法则在实验室研究中应用较为广泛。

酶溶法中常用的溶解酶有溶菌酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶、壳多糖酶、糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用,而其他几种酶对酵母作用显著。

而超声波破碎法的原理是声频为15~20kHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎,在处理少量样品时操作简便,液体量损失较少,同时还可对染色体DNA进行剪切,大大降低液体的粘稠度。

三、实验材料

1.诱导表达材料

(1)LB (Luria-Bertani))培养基(见实验七)。

(2)IPTG储备液:2g IPTG溶于10mL蒸馏水中,0.22μm滤膜过滤除菌,分装成1mL/份,-20℃保存。

(3)1×凝胶电泳加样缓冲液:50mmol/L Tris-Cl(pH6.8),50mmol/L DTT,2% SDS(电泳级),0.1%溴酚蓝,10%甘油。

2.大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料

(1)酶溶法

①裂解缓冲液:50 mmol/LTris-Cl(pH8.0),1 mmol/L EDTA,100 mmol/L naCl。

②50mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)。

③10mg/mL溶菌酶。

④脱氧胆酸。

⑤1mg/mL DNase I。

(2)超声破碎法

①TE缓冲液。

②2×SDS-PAGE凝胶电泳加样缓冲液:100mmol/L Tris-HCl (pH8.0),100mmol/L DTT,4%SDS,0.2%溴酚蓝,20%甘油。

四、实验步骤

1.外源基因的诱导表达

取上一个实验验证后的细菌进行下面实验。

(1)从平板上挑取单菌落,接种于5mlLB液体培养基中培养过夜,

(2)按照1∶50~1∶100的比例接种,37℃培养细菌数小时达到对数生长期后,取1ml备用,其余加IPTG至终浓度为1 mmol/L。继续培养3~5h。

(3)每小时取上述培养液1ml,1000g离心1min,取沉淀,加100μl聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后,作SDS-PAGE检测(具体操作步骤见实验十六)(图12-1)。

img18

图12-1 大肠杆菌原核表达

表达前;2.诱导表达2h;3.诱导表达4h)

2.大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化(www.anred.net.cn)

(1)酶溶法

①4℃,5000r/min离心15min,收集诱导表达的细菌培养液(100ml)。弃上清液,约每克湿菌加3ml裂解缓冲液,悬浮沉淀。

②每克菌加8μl PMSF及80μl溶菌酶,搅拌20min;边搅拌边每克菌加4mg脱氧胆酸(在冷室中进行)。

③37℃,玻棒搅拌,溶液变得粘稠时每克菌加20μl DNase I。室温放置至溶液不再粘稠。

(2)超声破碎法

①收集1L诱导表达的工程菌,40℃,5000r/min离心15min;弃上清液,约每克湿菌加3ml TE缓冲液。

②按超声处理仪厂家提供的功能参数进行破菌;10000g离心15min,分别收集上清液和沉淀。

③分别取少量上清液和沉淀,加入等体积的2×凝胶电泳加样缓冲液,进行SDS-PAGE。

注意事项:

超声破碎与声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型等因素有关,应根据具体情况掌握;超声波破菌前,标本经3~4次冻溶后更容易破碎。

五、方法评注

细菌质粒是一类双链闭环的DNA分子,它们可以利用宿主的酶和蛋白质进行独立复制和遗传。表达载体www.nnn91.com一般都含有强的启动子和有效的核糖体结合位点,当外源基因编码序列定向克隆入这些载体的多克隆位点之后,在适当的条件下(如温控诱导、化学诱导)诱导表达,就可产生目的蛋白质。这样表达的蛋白绝大多数为融合蛋白。融合表达具有高表达,高稳定性(相对于天然蛋白质)以及易鉴定和纯化等优点。

六、技术要点

(1)单菌落首先要进行活化,然后才能进行诱导表达;

(2)诱导表达时,菌液的生长状态非常重要,一般要求细菌处于对数生长期,可以检测菌液的OD600值,一般要求OD600nm在0.5~0.7;

(3)诱导温度,时间和IPTG的浓度对表达有很大的影响,可以影响外源蛋白质在宿主菌中的表达形式。如有些蛋白质需要在低温下(如20℃诱导)才能得到可溶性的表达。

1.包涵体的分离

蛋白质在细菌中的高水平表达,常形成在相差显微镜下可见的细胞质颗粒,即为包涵体,经离心沉淀后可用Triton-X100 / EDTA或尿素洗涤,若为获取可溶性的活性蛋白质,须将洗涤过的包涵体重新溶解并进行重折叠。

(1)试剂与配制

①洗涤液I:0.5% Triton X 100,10 mmol/L EDTA (pH8.0)溶于细胞裂解液中。

②2×凝胶电泳加样缓冲液。

(2)细胞裂解混合物12000g离心15min,4℃;弃上清液,沉淀用9倍体积洗涤液I悬浮;室温放置5min,12000g离心15min,4℃;吸出上清液,用100μl水重新悬浮沉淀;分别取10μl上清液和重新悬浮的沉淀,加10μl2×凝胶电泳加样缓冲液,进行SDSPAGE。

2.包涵体的溶解和复性

(1)试剂与配制

①缓冲液I:1 mmol/L PMSF,8mol /L尿素,10 mmol/L DTT溶于裂解缓冲液中。

②缓冲液Ⅱ:50 mmol/L KH2PO4,1 mmol/L EDTA (pH8.0),50 mmol/L NaCl,2 mmol/L还原型谷胱甘肽,1 mmowww.nnn91.coml/L氧化型谷胱甘肽

③KOH和HCl。

④2×凝胶电泳加样缓冲液。

(2)用100μl缓冲液I溶解包涵体;室温放置1h;加9倍体积缓冲液Ⅱ,室温放置30min,用KOH调到pH 10.7;用HCl调至pH8.0,在室温放置至少30min; 1000g离心15min,室温;吸出上清液并保留,用100μl2×凝胶电泳加样缓冲液溶解沉淀;取10μl上清液,加10μl2×凝胶电泳加样缓冲液,与20μwww.nnn91.coml重新溶解的沉淀进行SDS-PAGE。

注意事项:

①不同的大肠杆菌表达载体带有不同的启动子和诱导成分。实验者必须根据特定系统和用途决定相应的实验方案。

②表达和检测时,应设置对照组,如转化载体和非诱导细胞。

③由于大肠杆菌中表达的重组蛋白质缺少哺乳动物细胞特异的www.nnn91.com翻译后加工,所以,其生物活性无法与天然蛋白质相提并论。

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