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流感病毒基因组的提取_病毒生物实验

时间:2020-02-09百科知识
流感病毒基因组的提取_病毒生物实验

实验三 流感病毒基因组RNA的提取

一、实验目的

掌握从病毒中提取病毒基因组的方法。

二、实验原理

用强变性剂如异硫氰酸胍等溶液能够迅速溶解蛋白质,导致细胞结构破坏,核蛋白的二级结构遭到破坏,从核酸上解离下来,同时RNA酶也可被强变性剂(如4mol/L异硫氰酸胍溶液)以及β-巯基乙醇等灭活。从而得到www.jj11jj.com完整无损的RNAwww.jj11jj.com。

三、实验材料及器械

(1)收获的尿囊液(即流感病毒)。

(2)变性液2×Solution D、水饱和酚、氯仿、无水乙醇、无RNase的去离子水。

(3)高速离心机、tip头、Eppendorf管、微量加样器、干烤箱、紫外分光光度计。(www.anred.net.cn)

四、实验步骤

1.取收获的尿囊液(即流感病毒)1ml,加入1ml变性液2×Solution D,振荡30s,加入等体积的水饱和酚,0.2体积的氯仿,振荡30s,加入0.1倍体积的2mol/L NaAc (pH4.0),混匀。

2.冰浴约20min,4℃下12000g离心15min,取上清液,用酚/氯仿抽提两次,直至无蛋白层;取上清液,用氯仿再抽提一次。

3.取上清液,用2倍体积冰冷的无水乙醇沉淀,70%乙醇洗涤沉淀两次。

4.用无RNase的去离子水溶解RNA,紫外检测260nm、280www.jj11jj.comnm、230nm波长的吸光光密度值,初步估算RNA的纯度及浓度, -20℃保存备用。

五、方法评注

研究基因的表达和调控时,需要从组织或细胞中分离纯化RNA。RNA质量的高低常常影响后继工作(如RT-PCR、cDNA库构建和Northern www.jj11jj.comBlot等)的成败。RNA的提取围绕一条主线,即保护RNA的完整性,使RNA免受RNase的酶解。围绕这条主线,要关注RNase-Free工作环境的建立、RNase-Free条件的保持等系统的细节问题。

RNA提取物的完整性可通过电泳来检测。在有EB存在时,完整未降解的RNA制品电泳图谱应可清晰地看到18S rRNA、28S rRNA两条带,也应能看到一条较模糊的5S rRNA条带,且28S rRNA条带亮度应为18S rRNA的1.5~2倍。

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