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鸡胚的接种与收获_病毒生物实验

时间:2020-02-09百科知识联系我们
鸡胚的接种与收获_病毒生物实验

实验一 鸡胚的接种与收获

一、实验目的

了解鸡胚的发育过程以及基本构造;掌握鸡胚尿囊腔接种病毒以及收获病毒的方法,获得大量的流感病毒及抗原。

二、实验原理

鸡胚是正在发育中的机体,是有生命的实验动物,许多人类病毒和动物病毒、立克次氏体等均可以在鸡胚的相关部位繁殖。鸡胚可用作病毒的分离、制备抗原和疫苗,以及中和实验。

在本实验中,将流感病毒接种于鸡胚尿囊腔后,病毒就在尿囊的内胚层细胞繁殖,将繁殖的病毒颗粒释放至尿囊液中,从而使尿囊腔中含有大量病毒,通过收获尿囊液,可以得到较大量的流感病毒。

三、实验材料及器械

(1)9~11日龄鸡胚。

(2)甲型流感病毒(H1N1)。

(3)照蛋器、孵卵架、孵育箱、1ml注射器手机单机游戏、5号针头、三角锉刀、无菌镊子、眼科剪刀、毛细吸管。

(4)2.5%碘酒棉球、75%酒精棉球、透明胶纸(或固体石蜡)。

四、实验方法及步骤

1.尿囊腔接种

取孵育9~11日龄的鸡胚,在照蛋器上照视并用铅笔画出气室以及胚胎的位置(图1-1),在距气室底边0.5cm处的卵壳上标明开孔记号。以碘酒、酒精消毒开孔处,然后开一小孔,再用酒精消毒。

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图1-1 9~11日龄鸡胚结构示意图

注意事项:

此步应只钻破卵壳而不损坏壳膜。

注射针头由小孔刺入0.5~1cm,注射器向钝头方向倾斜约45°,注入0.1~0.2ml病毒液(图1-2),用透明胶纸封口(或将固体石蜡融化后封口)。置33~35℃孵育48~72h。自接种日起每日检视一次。

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图1-2 尿囊腔接种示意图

注意事项:

24h内死亡的多为非特异性因素所致,应及时剔除。

2.解剖及收获

流感病毒一般在接种48h后就可收获。收获前将鸡胚于4℃冰箱过夜或-20℃1h,将鸡胚冻死,使血球凝固,以免收获时红血球流出,影响收获的病毒滴度。(www.anred.net.cn)

经冰冻的鸡胚用碘酒、酒精消毒,用无菌镊子轻轻揭去气室部位卵壳,撕去壳膜,然后用无菌毛细管通过绒毛尿囊膜进入尿囊腔吸出尿囊液。收取的尿囊液可置无菌小瓶内4℃保存,或于-20℃保存待用。

五、方法评注

1.背景材料

病毒疫苗以及病毒研究是以培养、收获足够量的病毒为基础。病毒的生长和繁殖必须在细胞内进行。目前培养病毒的方法主要有两种,一种是通过病毒的细胞培养得到病毒,另一种是采用病毒感染动物(包括鸡胚)获得病毒。鸡胚是正在发育的活体,其组织分化程度低,细胞代谢旺盛,适于许多动物以及人类病毒的生长增殖。

鸡胚用于病毒培养具有来源充足,价格低廉,操作简单,无需特殊设备,易感病毒谱较广以手机单机游戏及对接种的病毒不产生抗体等许多优点,但也存在着明显的不足,如可能含有某些家禽病毒的母源抗体,甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、支原体、鸡白血病病毒、鸡贫血病毒等病原,可以通过采用无特定病原体(Specefic pathogen Free,SPF)级别的鸡胚来避免。

2.其他几种鸡胚接种方法

(1)卵黄囊内注射法

取6~8日龄鸡胚,从气室顶侧接种(针头插入3~3.5cm)(由于胚胎及卵黄囊位置已定,也可从侧面钻孔接种,侧面接种不易伤及鸡胚,但针头拔出后部分接种液有时会外溢,需用酒精棉球擦去),将针头插入卵黄囊接种0.1~0.2ml病毒液。其余步骤同尿囊腔内注射(图1-3)。

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图1-3 卵黄囊接种法

(2)绒毛尿囊膜接种(人工气室法与直接接种法)

①人工气室法

取10~11日龄鸡胚,先在照蛋器下画出气室位置,并选择绒毛尿囊膜区作一“记号” 。将胚蛋横卧于蛋座上,绒毛尿囊膜区“记号”朝上。用碘酒消毒记号处以及气室中心部,在气室中心部钻小孔。然后用锥子轻轻锥击记号处蛋壳,约0.5mm深,使其卵壳穿孔而壳膜不破。用洗耳球吸去气室内空气,随即因上面小孔进入空气而绒毛尿囊膜陷下形成一个人工气室,天然气室消失(图1-4)。自上面小孔直刺破卵膜进入人工气室3~5mm (接种时针头与卵壳成直角),注入0.1~0.2ml病毒于绒毛尿囊膜上。接种完毕用熔化的石蜡或者透明胶纸封闭两孔,人工气室向上,横卧于孵化箱中,逐日观察。

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图1-4 鸡胚绒毛尿囊膜人工气室接种

②直接接种法

将鸡胚直立于蛋座上,气室向上,在气室区中央消毒打孔,接种时针头先刺入卵壳约0.5cm,将病毒滴在气室内的壳膜上(0.1~0.2ml),再继续刺入1.0~1.5cm (刺破壳膜),拔出针头使病毒液慢慢渗透到气室下面的绒毛尿囊膜上,然后用石蜡手机单机游戏封孔,放入孵化箱培养。

本方法的原理为:壳膜被刺破后不能再闭手机单机游戏合,而绒毛尿囊膜有弹性,当针头拔出后被刺破的小孔立即又闭合。

(3)羊膜腔内接种(开窗法与盲刺法)

①开窗法

取10~11日龄鸡胚,直立于蛋座上,气室向上,在气室处去蛋壳使之开一个小窗,从窗口用小镊子剥开蛋膜,一只手用平头镊子夹住羊膜腔并向上提,另一只手注射0.05~0.1ml病毒液至羊膜腔内,然后用石蜡或者透明胶纸封闭人工窗,将蛋放入33~35℃孵育孵化箱中直立孵化。

此法可靠,但胚胎易受伤而死,而且易污染

②盲刺法

将鸡胚直立于蛋座上,将蛋转动使胚胎面向实验者。在气室顶部到边缘的一半处打一孔,用40mm长的针头垂直插入,约深30mm以上。如已刺入羊膜腔,能使针头拨动胚胎,即可注入病毒液0.1~0.2ml,如针头左右移动时胚胎随着移动,说明针头已刺入胚胎,这时应将针头稍稍提起后再注射。拔出针头后用石蜡或者透明胶纸封闭小孔。置孵化箱中培养。