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实验步骤_遗传学实验指导

时间:2020-02-09百科知识联系我们
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四、实验步骤

1.发根:将蚕豆、玉米、黑麦等植物种子用0.1%升汞消毒10min,经流水冲洗,温水浸种浸泡1~2天后,置25℃恒温箱中发根。待主根长到2cm左右时剪去主根(须根系植物的种子发出的主根不需剪掉),让其充分长出侧根。待侧根长到1~2cm时,于适宜时间用蒸馏水洗净,将水吸干,剪取根尖0.5~1cm进行预处理。

2.预处理:

(1)0.1%秋水仙素、或饱和对二氯苯水溶液、或0.002mol/L 8-羟基喹啉处理:将剪下的根尖立即放入0.1%秋水仙素、或饱和对二氯苯水溶液、或0.002mol/L 8-羟基喹啉中,以药液浸没根尖为度,处理3~4h。抑制和破坏纺锤丝的形成,使根尖细胞延迟其染色体的分离,增加中期分裂相,并使染色体分散于细胞中,以便观察计数。

(2)冷处理:将根尖放入盛有蒸馏水的指形管中,置0℃~4℃的冰箱(或在冰水)中处理24~40h,染色体数较多的实验材料可适当延长处理时间,但需注意勿使材料结冰。此法简便、安全,效果也好,而且经冰水混合物处理后细胞破裂程度较小,染色体不致丢失;其染色体的收缩程度较小,常用于显带技术,有利于得到更细致9游丰富的染色体带型。

(3)混合药剂处理:在某些情况下,采用混合药剂处理可取得更好的效果。如:100ml对二氯苯饱和水溶液加1~2滴α-溴萘饱和液处理3~4h,0.2%秋水仙素溶液加1滴α-溴萘饱和水溶液处理1~2h等。应该注意采用药剂处理时温度不能过高,以10℃~15℃为宜。

3.固定:材料经预处理后,用流水冲洗,然后投入甲醇-冰醋酸固定液(3∶1,现配现用)中固定20~24h,用95%的乙醇洗两次,转入70%乙醇中保存备用。固定的目的是将材料迅速杀死,并使染色体形态、结构尽可能保持不变和便于染色。

4.解离:常用酸解法:从70%乙醇中取出固定好的根尖,用流水冲洗3min,吸水纸吸干,放入小试管中加适量1 mol/L HCl于60℃水浴解离10~15min(蚕豆根尖10min,玉米、黑麦、洋葱15min)。对于玉米、黑麦和洋葱等,有时酸解后还可在25℃下酶解20min。

5.染色:针对不同材料或希望获得不同的效果,可选择适9游当的染液和染色方法。用于常规染色体形态结构鉴定的染色方法很多,常用的有如下几种。

(1)改良苯酚品红染色:若只作临时镜检观察,对解离后材料水洗并吸干,挑取根尖乳白色分生组织于载玻片上夹碎捣烂,滴加1~2滴染液,染色10~15min,压片。

(2)孚尔根反应染色:将解离材料洗净或直接转入席夫试剂于室温(最好在10℃左右)进行孚尔根染色反应1~5h或过夜,然后在1mol/L HCl中漂洗3次,每次5~10min,再经流水冲洗5~10min,保存于45%醋酸中供压片。若材料染色不足,也可再用1%醋酸洋红复染压片。

(www.anred.net.cn)

孚尔根反应是鉴别细胞中DNA的一种组织化学方法,它仅对核及染色体中的DNA显色,颜色比较均匀一致而清晰,细胞软化较好。染色后染色体一般比较柔软,压片时较长的染色体容易相互纠缠而不便于分散。试验表明,蚕豆、小麦、黑麦、洋葱、葱、蒜、百合等均适合于孚尔根染色。

注:孚尔根染色反应材料必须采用酸解法进行解离,并且对前处理要求较高,解离时间过长,孚尔根反应会减退;减退程度还与固定剂种类有关,一般甲醇-冰醋酸固定液(3∶1)的减退作用比FAA固定液明显。因此孚尔根反应染色可采用FAA固定材料,然后将固定材料经过50%乙醇转入水中,再转入1mol/L HCl中,于60℃水浴中解离5~15min,并迅速换入1mol/L冷HCl中。解离材料经水洗1~2次或直接进行孚尔根反应。

(3)1%醋酸洋红染色:若只作临时镜检观察,将解离水洗后的材料吸干,挑取根尖乳白色分生组织于载玻片上夹碎捣烂,滴加1~2滴染液,染色10~20min,压片。

(4)醋酸地衣红染色:将材料置盛染液的试管中,在酒精灯上加热3~5秒,反复2~3次,静置10~30min或更长时间。取出材料用染液压片,可在压片后稍加热以加深染色。

注:由于醋酸地衣红易溶于乙醇,因此70%乙醇保存材料取出后应当充分洗净后浸入45%醋酸中再进行染色。

(5)铁矾-苏木精染色:经HCl解离后的材料用流水彻底冲洗后,转入新鲜配制的4%铁矾溶液媒染2~4h(如加温至30℃~40℃媒染,则可缩短至1h左右),再用水冲洗20~25m9游in,务必将残留的铁矾洗净。媒染后材料转入0.5%苏木精中染色2~4h或更长时间(如加入苏木精后,染液很快混浊、发黑,则表示铁矾未洗净,需重新冲洗,再行染色),染色后用水冲洗5~10min,置45%醋酸内分色、软化10~20min(可再经1%氨水处理1min,使材料充分软化),压片(若染色后暂时不压片,可将材料转入70%乙醇或蒸馏水保存于4℃冰箱中)。

注:经染色后,除染色体能染上极深的蓝色外,细胞壁及细胞质也都能不同程度地着色;同时由于染色体吸附有媒染剂的金属离子,易变坚硬,压片后易分散。因此必须用45%醋酸处理,以使染色体呈深蓝色,而细胞质退淡,染色体软化。此法对各种植物的染色体均可染上较深的颜色、反差大、分色清晰,利于摄影和制片标本长期保存,为其他染色方法所不及。

6.压片:在经染色的材料上加一滴染液,盖上盖玻片,覆一层吸水纸,用带橡皮头的铅笔垂直敲打,或以拇指垂直紧压盖片(注意勿使盖片搓动),使材料分散压平,便于观察。

7.镜检:通常染色清晰而又分散得很好的分裂相只是少数,因此压片后要认真仔细地进行镜检。先在低倍镜下寻找有分裂相的视野,再用高倍镜或油镜仔细观察、计数或拍照。调节可变光栏与反光镜,使光线明暗合适,视场亮度适中。注意观察有丝分裂全过程的染色体形态变化,找出染色体分散好的中期细胞进行染色体计数,给好的分裂图像作上标记,以便再观察。

8.临时封片保存:制片短时间保存要防止玻片间的溶液干涸,空气进入,无法观察。临时片保存可在盖片周围滴上45%醋酸或染液,放入有湿滤纸的培养皿内,加盖后可保存数小时甚至一天。如制片标本符合要求,而又只需要短期(一般在一周以内)保存,可采用石蜡临时封片。用烧红解剖针挑取少量石蜡(或石蜡与凡士林等体积混合物)沿盖片周围封闭。

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