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用单层组织培养法培养家蚕的各种组织_高尚荫文选

时间:2020-02-09百科知识联系我们
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用单层组织培养法培养家蚕的各种组织

■ 刘年翠 谢天恩 高尚荫

为了研究家蚕脓病的防治问题,必须将脓病病毒接种到家蚕的身体中,因此利用组织培养法使家蚕的组织在体外生长,可以解决下面两个问题:(一)家蚕的饲养在武汉地区只能限于春季,如能用细胞传代法将家蚕各种组织细胞在体外生长及传代,则可将病毒接种到组织上,终年可做实验。(二)可在组织培养上筛选抗脓病病毒物质。

关于家蚕组织的培养,1935年Trager曾用悬滴法培养家蚕的各种组织,结果除卵数据库安全巢外,其余的组织如神经、脂肪、丝囊、腿或翅芽以及睾丸都不能生长。我们采用单层组织培养法,将家蚕的各种组织培养成功,并曾将脓病病毒接种在各种组织的单数据库安全层细胞上。现将所采用的方法及结果初步报告如下:

血清的采取:采血前先将健康的第五龄蚕儿浸没于1∶1000 HgCl2溶液中30~45分钟,再用无菌蒸馏水浸洗三次,每次10分钟,这样消毒以后,蚕儿仍能正常生长。取血清时首先从蚕儿的第三、四腹节上的脚采血,用小解剖剪刀将脚的中间部位剪去;若剪脚的基部,则内脏溢出,影响血流,且易污染,若剪脚尖,则所得血清量稀少。血液自所剪的脚下流出,盛于无菌离心管中,以每分钟2500~3000转离心沉淀10~15分钟,除去血中的细胞。用无菌吸管吸取上层血清注于无菌试管中,加盖橡皮塞,置4℃冰箱中保存备用。也可以从尾角取备,但血液流出缓慢,且量较少。采血操作愈快愈好,防止其氧化变黑。

单层细胞的制备:实验必须用严格的无菌步骤,一切的操作都在无菌室中进行。将健康的第五龄蚕儿浸没于1∶1000 HgCl2溶液中消毒,方法如上所述,但所用的蚕儿必须在实验前饥饿24~36小时,使其消化道内食料几乎没有残留,以免解剖时食道破裂而污染其他组织。将消毒的蚕儿置于无菌平板上,事前在平板中铺二层纱布,吸干蚕儿体上的水分,便于解剖。用左手固定蚕身,背部朝上,再用细小解剖剪刀先剪去背部的尾角,从尾角处向头部方向沿背部中线直到腹节的第三、四节,小心勿使食道破裂。用无菌镊子取下气管、皮肤、肌肉、食道、脂肪、丝囊、卵巢及睾丸等,分别置于盛有Trager液的小平板中。作为采丝囊的蚕儿必须年幼,因其丝囊还很小而其中丝汁不多(二龄蚕儿较好),如用五龄蚕儿,则丝囊的丝汁太多,不宜用作组织培养数据库安全的材料。采取数据库安全食道后必须先在无菌蒸馏水中洗涤数次去其内部残余的桑叶,用1∶1000 HgCl2溶液浸半小时,再以无菌蒸馏水浸洗三四次。将各种组织分别置于小试管中,用解剖小剪刀剪碎,直至几无可见的小块为止。加Trager液于各种剪碎组织中,用滴管连续不断地吸出吸入历20次,使单细胞脱离组织块而悬浮于Trager液中,将试管静置于试管架上10~15分钟,小碎块沉降于管底,而单细胞则浮悬于此上层液中。

单细胞的培养及观察:所有的培养液包含有Trager液9份、蚕血清1份,每毫升中青霉素100单位、链霉素100 mg。

克氏瓶(Carrel flask)培养法:分别用无菌吸管吸取上述的各种组织单细胞浮悬液0.5 ml,注入直径3.5 cm的克氏瓶中,并于各克氏瓶中加入培养液1.5 ml,加盖棉塞或橡皮塞,顺时针方向缓慢摇荡,充分混匀,但避免产生气泡,置28℃恒温箱中孵育。24小时后各种组织细胞即开始生长,48小时后可见各种组织细胞数目逐渐增加于瓶底,60小时及84小时后,即长成一层紧密、均匀而像薄纸似的细胞层。以卵巢细胞生长得最好,肌肉、睾丸次之,皮肤、气管再次之,食道和丝囊有的在实验室中生长,但有的则不生长。(www.anred.net.cn)

平板盖玻片法:先将18 mm×18 mm的盖玻片两块置于直径5 cm的平板内一同灭菌,吸取上述带有单细胞的各种组织细胞的悬浮液0.25 ml于每片盖玻片上摇荡,使之铺满全盖玻片,再加Trager培养液5 ml,将平板盖好置28℃恒温箱中,48小时后用肉眼观察细胞在盖玻片上长成一薄层,且蔓延到平板上,如将盖玻片取出,在显微镜下观察,可见单细胞紧密平铺在盖玻片上。但有的细胞之间有空隙,有些细胞彼此重叠。产生空隙的原因,多为原来接种细胞在那区域内数目不足,所以细胞生长分裂后还有空隙。细胞彼此重叠的原因是在悬浮液中除单细胞外,还有两三个细胞连成的小块生长繁殖后所致。利用此法可在显微镜下:(1)观察单细胞层的生长情况;(2)接种病毒后观察多角体的形成及细胞病变现象。

试管盖玻片法:此法与平板盖玻片法大致相同,所不同处在于利用Pyrex试管附盖玻片代替平板,作斜面培养。操作步骤、用途及结果与平板盖玻片相同。

曾试验过于Trager液中不加任何血清,结果各种组织的细胞生长不良。也曾于Trager液中加羊血清,但各种组织细胞不能于其中生长。

曾于各种组织单层细胞上接种过脓病病毒,试观察多角体的形成,其详细结构将于以后报告。

(1958年1月22日)

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