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利用分子生物学技术鉴定细菌_基金工程与分子生

时间:2020-02-09百科知识联系我们
利用分子生物学技术鉴定细菌_基金工程与分子生

实验二十一 利用分子生物学技术鉴定细菌

一、实验原理

16S rDNA是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16S rRNA)的基因,长度约为1.5kb,其序列包含10个可变区(variable region)和与之相同的11个恒定区新浪游戏总动员(constant region)。可变区因细菌而异,且变异程度与细菌的系统发育密切相关。16S rDNA是细菌系统分类研究中最有用和最常用的分子钟,越来越多的细菌依据16S rDNA被正确分类或重新分类,尤其是许多环境中的细菌。16S rDNA的保守性使应用单一方法进行细菌的统一检测新浪游戏总动员成为可能,尤其在苛养菌及生长缓慢的菌种的检测中具有十分明显的优势。

二、实验设计

1.提取基因组DNA,调整到合适浓度作为模新浪游戏总动员板,PCR扩增特异基因参考本实验附录。

2.合成16S rDNA特异引物:

Primer1:5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3';

Primer2:5'-T AAGGAGGTGATCCAAC-3'

3.将PCR产物电泳分离,切下特异带,进行胶回收纯化,参照实验五。

4.将纯化的DNA与T载体连接,不同组可进行不同DNA与T-载体比例的连接,参照实验六。

5.制备大肠杆菌感受态细胞,参照实验七。

6.重组质粒的转化、蓝白斑筛选和菌落PCR鉴定,参照实验八。

7.序列测定与同源性比较:经测序后所获序列用BLAST软件与GenBank数据库中的16S rDNA基因序列进行同源性比较。

8.应用RPD或CLUSTALW等软件构建系统树,并确定待测细菌的分类地位。

三、结果分析

1.利用16S rDNA可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定,和其他方法相比,16S rDNA序列测定分析更适用于确定属及属以上分类单位的亲缘关系。

2.16S rDNA的数据库信息及分析软件如下:

RDP(http//rdp.cme.msu.edu/html/)

CLUSTALW(ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/ClustalW)

ARB(http://www.ard-home.de/)

ORS(http://soul.mikro.biologie.tu-muenchen.de/ORS/)

OPD(http://www.com.msu.edu/OPD/)

各分析软件因采用的算法(algorithm)不同而各有所长。

附细菌基因组DNA提取方法(www.anred.net.cn)

1.实验试剂

(1)STE溶液:0.1mol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA(pH8.0)。

(2)1%SDS溶液:取1mL的1mol新浪游戏总动员/L NaOH和0.5mol/L SDS,另加3.5mL的蒸馏水

(3)TE缓冲液:10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/L EDTA。

(4)苯酚/氯仿:按苯酚与氯仿=25∶24的比例混合饱和苯酚与氯仿。

(5)50μg/mL RNaseA:10mmol/L Tris-HCl(pH7.5),15mmol/L NaCl,在100℃保温15min,然后温室条件下缓慢冷却。

2.实验仪器

培养箱,灭菌锅,超净工作台,低温高速离心机,台式高速离心机,微量移液器,真空干燥器,恒温水浴锅,恒温摇床,50mL离心管(有盖)及5mL离心管,冰箱,小试管,Eppendorf管,Eppendorf管架,吸头,吸头盒,旋转混合器,微型台式真空泵,陶瓷研钵,弯成钩状的小玻棒等。

3.实验步骤

(1)从平板培养基上挑选单菌种接种至5mL的液体LB培养基中,适当温度(37℃)条件下,振荡培养过夜。

(2)取1.5mL的培养液于Eppendorf管中,8000rpm离心5min,尽可能弃去上清液。

(3)向沉淀物中加入3mL STE,重新悬浮沉淀,8000rpm离心5min。

(4)去上清液,将沉淀溶入0.6mL TE中,制成悬浮液。

(5)向样品管中加入65μL10%SDS,剧烈震荡。

(6)将样品管放入65℃水浴中5~8min,溶液变澄清。

(7)加等体积苯酚/氯仿溶液,抽提三次。

(8)取上清液,向上清液中加1/10体积3mol/L的NaAC(pH5.2)。

(9)加等体积异丙醇沉淀DNA,用玻璃棒小心地挑出DNA。

(10)用70%乙醇洗一次,自然干后,加80μL TE溶解。

(11)-20℃保存。

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