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感受态细菌的制备及转化_分子生物学实验指

时间:2020-02-09百科知识联系我们
感受态细菌的制备及转化_分子生物学实验指

实验三 感受态细菌的制备及转化

一、实验目的

要求学生掌握分子生物学实验中两种细菌转化的原理,以及CaCl2法转化和电穿孔法转化感受态细胞的制备,外源质粒DNA转入感受态细胞以及转化子筛选的方法。了解细菌转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。

二、实验原理

CaCl2转化法原理:许多细菌(如大肠杆菌)不能摄取有功能活性的DNA,但可以通过人工的方法导入DNA,用CaCl2处理受体菌(本实验用E.coli DH5α作为受体菌),可诱导短暂的“感受态”,使之具有摄取外源DNA的能力,从而能摄取不同来源的DNA。DNA与Ca2+结合亦可形成对DNase有抗性的复合物,并结合在细菌表面,经过短暂的42℃热激可促进细菌摄取DNA-Ca2+复合物,提高转化效率。然而即使在最佳条件下,也只能将部分质粒DNA导入受体菌。为鉴定这些转化子,需利用质粒的筛选标记。这些标记赋予细菌以新的表型,使转化成功的细菌很容易被筛选出来。如pUC19质粒带有氨苄青霉素抗性基因(ampicillin resistance gene),以其转化的E.coli DH5α就能够在含氨苄青霉素的选择培养基上生长,未转化的受体菌则不能在这种选择培养基上生长。

电穿孔高效转化法原理:利用高电势差的作用,使感受态细胞表面受损,产生微小的“孔”,然后外源质粒DNA分子通过此“孔”进入细胞内,从而实现转化,使宿主细胞产生新的表型。与CaCl2相比,电穿孔法的转化效率较高。

三、实验仪器、材料与主要试剂

1.仪器

恒温摇床,生化培养箱,水浴锅,超净工作台,分光光度计,全自动灭菌锅,台式离心机,电转化仪,微量移液器离心管,Epperdorf管。

2.材料

大肠杆菌单菌落,pUC18质粒。

3.试剂

SOC培养基,LB和LA培养基,CaCl2溶液(0.1mol/L CaCl2,10%甘油,ampicillin溶液(100mg/mL)(使用终浓度1000μg/mL)。

四、实验步骤

1.CaCl2转化法

(1)接种一个大肠杆菌的单菌落于50mL LB培养液中,于220r/min摇床中37℃培养过夜。

(2)在一个2L的三角瓶中加入400mL LB培养液中,再加入4mL培养液,于37℃摇床(220r/min)过夜培养至OD600=0.5~0.7。

(3)将培养液分别转至8个50mL预冷无菌的聚丙烯管中,于冰上放置10min,然后于4℃下,4000r/min离心5min,弃上清液。

(4)细胞沉淀用10mL冰冷的CaCl2溶液重悬,于4℃,以4000r/min离心5min,弃上清液。

(5)细胞沉淀用10mL冰冷的CaCl2溶液重悬,冰上放置30min,于4℃,4000r/min离心5min,弃上清液。

(6)用2mL冰冷的CaCl2溶液重悬各管细胞,然后按每管250μL的量分装于预冷的无菌聚丙烯管中,立即冻存于-70℃。

(7)按照以下各步骤使用感受态细菌。

①取体积相当10ng的pUC18与100μL感受态DH5α混匀,已知质粒用无菌水和同时做正对照和负对照,方法如上。

②冰浴30min,42℃热激60~120s,再加入400μL LB并置于37℃振荡培养45min,然后再按照梯度涂ampicillin抗性LA平板。

2.电穿孔高效转化法(www.anred.net.cn)

(1)DH5α在LA平板上画线,37℃培养12小时

(2)从平板上挑取单菌落,接入装有5mL SOC培养基的universal瓶中,37℃摇床培养12小时(220r/m)

(3)按1∶100的比例将菌液转接入4个250mL SOC培养基中。37℃摇床培养(220r/m)。

(4)当OD值达到0.7~0.8时,将菌液取出,用250mL的离心管4℃7000r/m离心5min。

(5)用去离子水清洗菌体。在vortex上用残余的液体把沉淀打散,加入50~100mL的去离子水,在vortex上剧烈震荡,直至菌液均匀。离心,条件同上。

(6)重复步骤5。弃上清液,用10%Glycerol清洗菌体,在vortex上用残余的液体把沉淀打散,加入50~100mL的10%Glycerol,在vortex上剧烈震荡,直至菌液均匀。离心,条件同上。

(7)重复步骤6,2次。

(8)测试。取20μL菌液进行电转,要求无电火花。

(9)将菌液装入预冷的0.5mL Ep管中,每管40μL。

(10)-70℃保存。

(11)将一定量的pUC18与40μL的感受态混匀,移入电转化杯中,于电转化仪中转化,然后立即加入冰冷的LB,置于37℃预培养30~60min。

(12)按照步骤11,同时做一正对照和负对照。

(13)按照梯度,涂含ampicillin的LA平板,待菌液吸干后,置于37℃培养箱中培养。

五、实验结果

计转化子的数量,从而算出转化频率,与CaCl2转化法做对比。

转化率=转化子的个数/质粒DNA的量(ng)

六、注意事项

感受态细胞转化频率的高低与菌体的生长状况联系紧密,对数生长期的菌体制备的感受态细胞,相对而言,转化频率较高。

CaCl2转化法时热激的时间与温度很重要,一般温度为42℃,时间不能超过120秒。

转化对细胞来说是一个破损过程,所以预培养有利于转化频率的提高。

电转化时,细胞一定要充分洗涤,感受态制备完后,应做空转实验,以便补救。

七、思考题

1.CaCl2转化与电穿孔法转化的原理,导致二者转化频率差异的原因是什么?

2.转化子筛选的原理是什么?