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基因转移系统_分子生物学技术

时间:2020-02-09百科知识
基因转移系统_分子生物学技术

第三节 基因转移系统

如果说基因治疗在疾病的治疗中犹如“武器”,那么治疗所选择的基因就是“弹药”,而基因转移系统则是基因治疗的“枪炮”。无论基因治疗采用哪一种途径,都必须通过适当的基因转移系统将外源基因转移至特定细胞内。常用的基因转移系统可以归结为两类:一类是病毒载体系统,即利用载有外源基因的缺陷病毒去感染受体细胞,将外源基因导入细胞;另一类是非病毒载体系统,即通过物理、化学或除病毒载体外的其他生物学方法将外源基因导入细胞。两种载体系统,各有利弊。目前的基因治疗方案中病毒载体占了较大比重,但是近来对生物安全性的要求提高,以及病毒载体基因治疗发生的事故,使得非病毒载体的关注日益升温。

一、病毒载体系统

人类设想的基因转移系统最初是根据病毒感染人体的原理设计的,充分利用了病毒高度进化所具有的感染和寄生特性。是将有害的病毒进行改造,用治疗基因替换病毒内部的有害基因。然后,将重组的病毒基因组用包装细胞系包裹,形成假病毒颗粒,从包装细胞系中分离所生成的假病毒颗粒,再用这种改造过的假病毒颗粒去感染靶细胞,释放出含治疗基因的DNA,治疗基因可以随机或定点整合进入靶细胞基因组中,最终靶细胞表达治疗基因的产物,从而发挥治疗疾病的作用。

大多数野生型病毒对人体都具有致病性,需要对其进行改造才能用于人体。理论上各种类型的病毒都能被改造成病毒载体,但是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系,人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生发展的关系等的认识还很不全面,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。

病毒介导的基因转移是目前最为成熟的方法,面临的最大问题是对人体的安全性,尤其是长期安全性。

就目前的认识水平而言,理想的病毒载体应具备以下条件:①生物安全性,这是前提。载体本身对机体不致病、不引起免疫反应,至少是弱免疫原性。②携带外源基因并能被包装成病毒颗粒。③介导外源基因的转移和表达,同时,治疗基因转染效率高、表达水平高、时间长。④靶向性基因传递。⑤基因表达可以调控。⑥容易生产,最好能生产出达商业规模的高滴度产品。

下面介绍几种常用的病毒载体。

1.反转录病毒(retrovirus,RV)载体 这是目前临床医学操作上了解最多的一种病毒载体。虽然它是一种RNA病毒,但其生活史中曾经过反转录的作用,形成DNA,并将DNA嵌入宿主染色体中,故其优点在于可形成长效型的基因,长时间存在并表达。但这个病毒载体只能感染分裂期的细胞,不能用在不分裂的组织或细胞上。

野生型反转录病毒基因组结构和重组反转录病毒构建过程示意图如图15-1所示。

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图15-1 野生型反转录病毒基因组结构和重组反转录病毒构建过程示意图

反转录病毒载体系统的特点:①高效地感染处于分裂期的靶细胞;②感染细胞后能够将前病毒基因组稳定地整合到靶细胞基因组的随机位点上,可以长期、稳定地进行基因表达,并且可以遗传;③反转录病毒基因组比较小,到目前为止,可包装的外源DNA最大只有8kb;④不会引起体内免疫反应;⑤技术比较成熟,一般使用反转录病毒载体时,可先将细胞分离到体外,经由载体转移进某一特定的基因后,再将该细胞送回活体内,即用ex vivo途径进行基因治疗;⑥该类载体在染色体上的随机整合,有可能造成插入突变、原癌基因的激活以及细胞中某些正常基因的表达异常,因而具有潜在的危险性。

2.腺病毒(adenovirus,AV)载体 AV是无包膜的线性ds DNA病毒,曾经在研究真核细胞DNA复制、转录、RNA剪接、蛋白质合成等方面作出过重要贡献。腺病毒在自然界分布广泛,至少存在100种以上的血清型,人类是AV的自然宿主。

野生型AV基因组结构和重组AV构建过程示意图如图15-2所示。AV载体具有几种显著特点:①基因组大,因而可插入大片段外源基因(至多可达35kb);②可高效地转导不同类型的人组织细胞;③由于AV蛋白的表达不以宿主细胞增殖为必要条件,所以,AV载体可转导分裂或非分裂期的细胞;④在细胞培养物中可获得高滴度的重组病毒(>1011/ml);⑤进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组,仅瞬间表达,并且AV最多引起人呼吸道轻微炎症,不会引起肿瘤,因而安全性较高。但往往需要重复应用,所以可能诱发机体的免疫反应。

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图15-2 野生型AV基因组结构和重组AV构建过程示意图

事实上,AV载体的最大问题就在于会引起强烈的免疫反应,造成患者严重的发炎现象或不良反应。虽然第2、第3代的AV载体陆续问世,希望借由剔除更多病毒基因组的部分,来降低病毒蛋白所带来的免疫现象,但这种强烈的免疫作用,似乎仍然不容易免除。因此,在使用AV载体时,如何掌握有效的剂量,避免造成严重的免疫反应,的确是一件不容易的事。(www.anred.net.cn)

3.腺相关病毒(adeno-associated-virus,AAV)载体 AAV是一种缺陷型单链DNA病毒,人群中的大多数都受过它的感染,但从未发现它能引起任何疾病,可以说AAV是一种安全的病毒。用AAV作为载体可以感染多种类型的人体细胞,可以使治疗基因定点整合于人类19号染色体长臂19q13.3-qter的特定区域,在体内获得长期、稳定地表达。由于在构建载体时去掉了AAV本身的基因,所以避免了病毒可能带来的免疫反应。可用体内注射的方式给予患者。但AAV有一个较大的缺点,即它是一种很小的DNA病毒,故其可以容纳的外源基因大小非常有限。

由于AAV载体的理化性质稳定,在制备、储存和用药过程中与很多传统药物条件相似。

4.单纯疱疹病毒(hepes simple virus,HSV)载体 HSV是一种嗜神经性病毒,在体内感染时,优先传播至神经系统。在神经元内,病毒颗粒可通过逆行和前行机制运动,选择性地通过触突转移。因而,HSV可以从周围神经系统进入中枢神经系统,并在神经元中建立长期稳定的隐性感染。

HSV载体可以感染分裂和非分裂期细胞,尤其适用于神经系统疾病的基因治疗。虽不能整合,但可在细胞内长期存在。所插入外源基因的容量也很大,达30kb。

二、非病毒载体系统

其本质是将基因治疗中的基因看作为药物,然后从药剂和药理学角度来考虑如何把基因导入靶细胞或组织、器官并进行表达。由于常用的DNA为超螺旋结构或开环结构,空间体积太大,并且不能有效主动进入细胞,所以必须进行缩合及依赖其他分子或技术的辅助,以组装成高度有序的结构,使体积变为原来的1%以下,易于导入靶细胞。

非病毒载体的优势在于其生物安全性高、低毒性、低免疫原性、基因不整合、靶向性好及易于组装等。但目前非病毒载体的转移效率还不高。

1.裸DNA直接转移 该类载体主要通过直接的物理或机械方法导入易及部位,如皮肤、骨骼肌、肝脏、支气管、心肌和瘤体内等。当其用于激发免疫反应时即为DNA疫苗。该法转入的DNA只能在局部起作用,并可能需要进行外科手术以暴露靶器官。对全身用药来说,裸DNA需要保护以免其从给药部位迁移至基因表达部位的过程中被核酸内切酶降解。下面列举的是一些裸DNA直接转移的方法。

(1)DNA直接注射:肌肉、血管、心肌等可以直接被注射,实现局部组织的基因转移,并表达出相应的蛋白质。但总体上基因转移效率低,难以达到实际应用的目的。

(2)基因针:针灸针上,预先涂以带正电荷的多聚赖氨酸或鱼精蛋白,通过离子引力将DNA附着在针灸针上,经皮肤刺入肌肉或组织内,进行捻转插提,并可通以直流电刺激。

(3)基因缝线:将裸DNA通过多聚赖氨酸或鱼精蛋白,直接黏附在手术缝合线上,进行肌肉、血管、心肌等的缝合。这种方法将基因黏附在手术缝线上,可以避免直接注射裸DNA后的流失,使其长期滞留在局部组织,发挥持续的转基因作用。

(4)基因枪:又称微粒轰击技术。采用能自发吸收DNA的钨或金微粒,通过高压电产生的高能电弧促使DNA包被的金属颗粒产生高速度,能有效穿透单细胞层或靶器官从而将DNA导入培养细胞或动物组织中。其转移效率较直接注射法高,但面积小,转基因数量有限,且费用高。

(5)电穿孔法(电脉冲介导法):由于细胞内、外离子分布的不平衡,在静息状态下,细胞表面多带正电荷,在高压电脉冲作用下,细胞表面曲度和离子分布会发生瞬时可复性的变化,形成电穴位或电通道,在电场驱动下将带电荷DNA分子迅速导入细胞内,实现基因的电转移。操作时可以在肌肉局部或血管周围组织中,插入两根平行针电极或应用皮肤表面电极,通以方波脉冲电场进行刺激。

(6)超声导入:超声作用于细胞膜后,使细胞膜上出现瞬间微小的孔洞,外源DNA通过细胞膜上的小孔进入细胞。

2.脂质体介导的基因转移 用人工方法将磷脂在水溶液中形成一种脂质双层包围水溶液的脂质微球,称脂质体。通过脂质体膜与体细胞的相互作用(包括膜融合、被吞噬等),把含有特殊功能的生物大分子及小分子药物导入细胞中。

比如,可以用带正电荷的脂质体和带负电荷的含有治疗基因的DNA,经简单混合后,在静电引力作用下,形成阳离子脂质体/DNA复合物。当此复合物与靶细胞结合时,可以通过胞吞作用,将治疗基因导入靶细胞中。阳离子脂质体导入介质系统一般由阳性脂质和中性的辅脂质组成。辅脂质能促进DNA从阳离子脂质体中释放。对于体内基因转染,辅脂质的选择应依据给药途径。气管和组织给药时,选用含双油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的阳性脂质体可提高DNA的转染率,DOPE能和复合物形成六面体,利于复合物与转染细胞膜的融合,促进DNA的释放;而由静脉给药时,用胆固醇(Chol)代替DOPE能使基因转染效率明显提高,尤其是在肺内的转染效率。

3.受体介导的基因转移 阳离子多聚物偶联上配体,配体可选择半乳糖、甘露糖、内皮细胞生长因子、纤维细胞生长因子及各种单抗等,再与核酸混合,经适当处理,可以形成配体-阳离子多聚物-DNA的复合体,这种复合体可被细胞表面的特异性受体识别,并吞噬到细胞中。

4.其他 比如近年来发展起来的纳米技术的载体等。

正如一个疾病的治疗一样,治疗的方法越多,就证明还没有一个最有效的治疗手段。基因治疗的载体系统也是同样,很难说哪种载体具有高转染、高表达、低毒性的全部优点。可以说病毒和非病毒载体各有其发展前景和很好的应用。病毒载体的发展依赖于基础医学、分子病毒学的发展;非病毒载体的发展依赖于化学、物理、材料科学的发展,使其发挥高效、安全的优势。

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