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干扰技术的应用_分子生物学技术

时间:2020-02-09百科知识联系我们
干扰技术的应用_分子生物学技术

第三节 RNA干扰技术的应用

RNAi是基因功能研究和基因治疗研究的有力手段,已在基因功能的确定、信号转导通路研究和基因治疗等方面发挥重要作用。相信随着对RNAi机制的深入了解和技术的改进,RNAi将获得更广泛的应用。

一、基因功能研究

目前,针对某个已知的基因,设计可诱导其表达抑制的siRNA,通过合适的方法导入细胞或机体,使该基因的表达水平下降或完全抑制,从而了解该基因的功能,是RNAi技术在目前最广泛的应用。

2000年人类基因草图绘制完毕和一些模式生物基因研究的顺利进行,生命科学研究已进入后基因组时代,在功能基因组研究中,需要对特定基因进行功能丧失或降低突变,以确定其功能。RNAi技术为功能基因组的研究提供了一种新的工具,使工作进程大大加快。将体外构建的siRNA分别导入Hela细胞、大鼠成纤维细胞和3T3细胞,分别抑制了哺乳动物的laminB1、laminB2、NUP153、GAS41、ARC21、cdk1、β2actin及γ2actin等21个不同类型的基因,均获得成功。

最近,RNAi-Microarrays技术的发展,给高通量的基因功能研究带来了曙光。RNAi-Microarrays的基本原理是:把表达shRNA载体点在“芯片”上,再加入转染试剂和哺乳动物细胞进行培养,而后对细胞表型进行扫描,或在mRNA和蛋白质水平上进行检测,其中“芯片”上不同点代表了由不同shRNA导致的细胞缺失表型。

二、信号转导通路研究

由于RNAi能高效特异地阻断基因的表达,与传统的缺失突变技术联合使用,可以比较容易确定复杂的信号传导途径中不同信使的上下游关系,将可能成为研究细胞信号通路的有力工具。应用RNAi进行的果蝇细胞胰岛素信号传导途径研究,取得了与已知胰岛素信号传导通路完全一致的结果。在线虫体内,胰岛素与其受体结合后,可以活化Dsor1,其随后再激活ErkA。以Dsor1为靶目标的dsRNA阻断了Dsor1的表达后,胰岛素刺激后,ErkA就不能被活化。

三、基因治疗

随着对疾病本质的深入了解和新的分子生物学技术的出现,广义上把通过改变人体内的基因表达以达到治疗疾病目的的方法均可称为基因治疗。用RNAi特异性地抑制如人类免疫缺陷病毒(HIV)基因、肝炎病毒基因、癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达,使这类基因保持在静默或休眠状态,从而有望用这种新的手段治疗各种病毒性疾病和恶性肿瘤等疑难病症。

1.抗病毒 可以针对病毒入侵、复制、转座子活动等设计siRNA,使这类基因保持再静默或休眠状态,从而有望用这种新的手段治疗各种病毒性疾病。例如,人们针对HIV生活周期的不同阶段设计了多种siRNA,针对HIV gag、tat、rev、nef等基因的siRNA可用于控制病毒复制。又如针对乙肝病毒(HBV)的X蛋白和核心蛋白表达所设计的siRNA可以有效并特异性的减少HBV的表达。RNAi抗其他病毒的作用也在研究中。当然,从目前到真正把RNAi应用于病毒的基因治疗还有较远的路要走。

2.抗肿瘤 肿瘤是一种多基因、多因素疾病,针对单个基因的基因治疗一般不能取得好的效果。RNAi技术可以针对信号通路的多个基因或者基因族的共同序列来同时抑制多个基因的表达,从而能够更有效地抑制肿瘤生长。此外,RNAi技术的识别可以精确到一个核苷酸,对由野生型点突变形成的癌基因,能够产生准确有效的封闭效果,野生型基因则不受影响。利用siRNA特异地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达,而且抑制效果互不干扰,从而有望达到抗肿瘤作用。

在白血病和淋巴瘤的研究中,应用RNAi成功地抑制了细胞的生长分化。血管内皮细胞生长因子(VEGF)在肿瘤的发生、发展中起重要作用,利用合成VEGF的siRNA特异性地封闭了VEGF的表达,有效抑制了肿瘤细胞的生长,达到了很好的抗肿瘤生长及抗肿瘤转移的目的。以端粒酶为靶点利用RNAi技术抑制肿瘤的研究也取得了满意的结果。信号转导通路中蛋白质分子的突变也是癌症发生的主要因素之一,约30%的癌症是由信号通路中的ras基因突变造成的,所以可通过抑制ras基因的表达治疗癌症。

3.其他疾病治疗 通过fas和caspase 8的siRNA可抑制Fas和Caspase 8在肝脏中的表达,治疗由它们介导的自身免疫性肝脏疾病。RNAi为炎症和动脉粥样硬化疾病提供一种新的治疗方法。同时,RNAi将是治疗肌肉萎缩侧索硬化症(ALS)的一种有效方法。研究发现,遗传性ALS的发病原因是一种SOD1的蛋白基因发生了突变,在小鼠中导入抑制SOD1合成的siRNA,可以推迟小鼠ALS的发病,并降低该疾病的发展速度。通过RNAi治疗其他疾病的研究也在探索中。

四、药物开发

RNAi技术可作为寻找新药物靶标的工具,可快速、大规模、高通量地对已发现的药物靶基因进行功能分析。同时,siRNA基因药物具有高度的序列特异性和非常小的毒副作用。利用这个技术可以用于确定人类细胞中的疾病途径,为小分子药物筛选靶物质,以及建立新的生物制药方法和诊断学方法。再者,它还能帮助鉴定药物作用的生化模式,以及其他与此作用相关的基因。RNAi技术已被作为高通量药物靶标识别和确认的工具之一。

五、RNAi转基因动物研究

通过转基因技术研究RNAi转基因动物,从而在全身组织细胞中抑制靶基因表达是RNAi技术的一个重要应用。传统的基因敲除技术由于需要消耗大量的时间和资源,因而不可能成为大规模制备转基因动物模型的手段,并且其应用于哺乳动物的最大障碍为哺乳动物的染色体是二倍体,获得的转基因动物常为嵌合体,需经过多代杂交繁育才能得到纯合的转基因动物。RNAi技术具有高度特异性、高效性和低成本等优点,而且shRNA是使显性基因功能失活,从而解决了上述障碍。siRNA可以在一个转基因动物体内同时沉默两种或更多基因,加快了获得突变的转基因动物的进程。并且通过制备针对靶基因mRNA不同区段的siRNA转基因动物,有可能获得对靶基因不同程度的沉默效果,从而可以模拟数量遗传性状。

六、展望

RNAi发现距今刚10年,已显示了广阔的应用前景,但仍面临一些尚未解决的问题。首先在下调目的基因表达的同时,也可能同时伴随其他基因表达水平的改变,称为off-target效应,因为基因的表达受到众多因子的调节,目的基因产物很可能是其他基因表达的调节因子。其次,RNAi的放大效应可能会使靶基因邻近基因沉默而使其表型缺失。另外根据靶基因设计的siRNA序列,需在Genebank中查询以确保其唯一性,这是假定Genebank中基因序列齐全的前提下进行的,并不能杜绝siRNA对未知基因的影响。其他问题包括:①在一些基因或组织具有抵抗RNAi的能力;②哺乳动物中RNAi的抑制效果不如低等生物的效果好,并对丰富表达的靶基因抑制效果不高;③RNAi技术在哺乳动物整体水平的研究还只是涉及了大鼠和小鼠;④还应当进一步提高siRNA或shRNA导入细胞的效率等。相信随着人们对RNAi研究的不断深入,RNAi技术将对医学和生物学的发展产生深远的影响,有着更加广阔的应用前景。

(潘銮凤)

参考文献

1.胡颖,叶枫,谢幸.RNA干扰技术的合成技术和转运系统研究进展.国际检验医学杂志,2007,28(10):932~935(www.anred.net.cn)

2.应彩云,钟鸣.RNA干扰技术的应用.中国现代医生,2007,45(20):152~154

3.张向阳.RNAi技术及其应用.济宁医学院学报,2006,29(3):79~81

4.张定校等.RNA干涉(RNAi)技术应用于哺乳动物细胞的研究策略.遗传,2005,27(5):839~844

5.谭效忠,尹昆,杜舟.RNA干扰及其应用.山东师范大学学报(自然科学版),2006,21(3):126~128

6.信吉阁等.RNA干扰技术的应用研究进展.动物医学进展,2006,27(2):302~33

7.刘杰凤,王志辉,李春晖.干扰用于基因治疗的研究进展.生物技术通讯,2006,17(2):276~278

8.张丽娜等.RNA干涉研究进展.西北师范大学学报(自然科学版),2006,42(5):105~111

9.杨广,李小鹰.RNA干扰技术在哺乳动物中的应用.中国分子心脏病学杂志,2006,6(1):50~54

10.张定校等.RNA干涉(RNAi)技术应用于哺乳动物细胞的研究策略.遗传,2005,7(5):839~844

11.张敏,白春学,张新.RNA干扰的研究进展.国外医学·分子生物学分册,2003,25(1):55~58

12.马中良,杨怀义,田波.真核生物中的微小RNA及其功能研究进展.遗传学报,2003,30(7):693~696

13.王丽娜,袁崇刚.RNAi在药物研究中的应用.生命科学,2007,19(5):557~561

14.廖银花,贺修胜.RNA干扰研究进展.现代生物医学进展,2007,7(5):773~776

15.涂知明,方华舟,杜红.RNA干扰技术(RNAi)在医学上的应用研究.中国优生与遗传杂志,2007,15(4):1~4

16.汤华主编.RNA干扰原理与应用.北京:科学出版社,2006

17.邓庆,黄健,韩泽广.MicroRNA功能研究进展.生命科学研究,2006,10(2):91~93

18.杜秋丽.miRNA及其功能研究.生物学通报,2004,39(8):13~15

19.Fire A,Xu S,Montgomery MK,et al.Potent and spe-cific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Nature,1998,391:806~811

20.Hannon GJ.RNA interference.Nature,2002,418:244~251

21.Guo SA and Kemphues KJ.Par-1,2gene required for establishing polarity in C.elegans embryos,encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed.Cell,1995,81(4):611~620

22.Napoli C,Lemieux C,and Jorgensen.Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans.Plat Cell,1990,2:279

23.Elbashir SM,et al.Duplexes of 21-nucleotides RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.Nature,2001,411(6836):494~498

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