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芯片技术的操作流程_分子生物学技术

时间:2020-02-09百科知识联系我们
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第二节 DNA芯片技术的操作流程

DNA芯片技术基本操作流程(图7-1)如下:①芯片的制备;②待检测样品的制备和标记;③分子杂交;④图像采集和软件分析。

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图7-1 DNA芯片技术基本操作流程

一、芯片的制备

根据实验目的设计点阵,也就是芯片上固casewhen相探针的序列以及排布方式,这是制备芯片的第一步。根据设计好的点阵可以从如下途径获得芯片:直接购买商品化芯片、向厂方定做、自行制备。

目前,制备DNA芯片的固相支持物大致可分为两类:①实性材料,包括硅片、玻片、瓷片等;②膜性材料,包括聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维素膜等。固相支持物使用前,需要进行预处理。一般实性材料的表面要使其衍生出羟基、氨基等活性基团,以便和活化的单核苷酸发生化学反应而结合;而膜性材料上则通常要包被氨基硅烷或多聚赖氨酸,使表面带上正电荷以吸附带负电荷的DNA探针。

DNA芯片表面的探针一般通过原位合成技术或预合成后直接点样的方法固定于固相支持物上。

(一)原位合成芯片的制备

适用于寡核苷酸探针。可采用原位光刻合成技术或压电打印技术,在芯片的特定区域原位合成寡核苷酸而制备。

1.原位光刻合成技术 美国Affymetrix公司的专利。采用的技术原理(图7-2)为:在合成碱基单体的5′羟基末端连上一个光敏保护基团。首先使支持物羟基化,并用光敏保护基团将其保护起来。每次选取适casewhen当的蔽光膜(mask)使需要聚合的部位透光,其他部位不透光。这样,光通过蔽光膜照射到支持物上,受光部位的羟基脱保护而活化。因为合成所用的单体分子一端按传统固相合成方法活化,另一端受光敏保护基团的保护,所以发生偶联的部位反应后仍旧带有光敏保护基团。因此,每次通过控制蔽光膜的图案(透光与不透光)决定哪些区域应被活化,以及所用单体的种类和反应次序就可以实现在待定位点合成大量预定序列寡聚体的目的。使用多种蔽光膜能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列,在合成循环中探针数目呈指数增长。某一含N个核苷酸的寡聚核苷酸,通过4×N个化学步骤能合成出4N个可能结构。例如:一段8个碱基的寡核苷酸有65536种排列的可能,通过32个化学步骤,8小时就能合成65536个探针。

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图7-2 原位光刻合成技术原理示意图

引自Affymetrix公司资料介绍

该方法的主要优点是可以用很少的步骤合成极其大量的探针阵列。在上述例子中合成65536个不同序列的8聚体寡核苷酸探针仅需4×8=32步操作,8小时就可以完成。而如果用传统方法合成然后点样,那么工作量的巨大将是不可思议的。同时,用该方法合成的探针阵列密度可高达106/cm2。不过,该方法每步合成反应产率比较低(<95%)。因此,探针的长度受到了限制。

2.压电打印法 该方法的原理类似彩色喷墨打印,但有多个芯片喷印头及储液囊,储液囊中装有4种碱基合成试剂,喷印头可在整个芯片上移动。支持物经包被后,根据芯片上不同位点探针的序列,喷印头将需要的特定碱基及合成试剂喷印在芯片上特定位置,经冲洗、去保护、偶联等步骤的循环,核苷酸依次结合、延伸,合成所需要的探针。该技术的化学原理与传统的DNA固相合成一致,每步产率可达99%,可以合成40~50nt长度的探针。

(二)DNA微集阵列芯片的制备

DNA微集阵列芯片的制备采用的方式是预先合成DNA探针,通过点样法将探针定量点样于固相支持物的特定位置,再经紫外线交联固定即可。紫外线照射可使DNA探针中的胸腺嘧啶残基与支持物(如硅烷玻片)上带正电的氨基形成共价键而使探针固定在支持物上。

点样探针的制备是非常关键的一步。探针的纯度、杂交特异性直接决定芯片的质量和可信度。可以说没有好的点样探针,制备的芯片就没有什么意义。点样的探针可采用:①已克隆的基因片段;②PCR、RT/PCR等方法扩增的片段;③人工合成的DNA片段等。

(www.anred.net.cn)

固相支持物一般采用已经过特定处理的带正电荷的尼龙膜或硅片、玻片等。

DNA微集阵列芯片的制备需要阵列点样机或称阵列复制器。主要部件包括:计算机控制的高精度的三轴移动机械装置、点样枪及枪头的清洗与风干装置。其中最关键的部位是点样的枪头,其严格的技术要求有:①所有的枪头顶端处于同一平面上,以保证所点的样品能同时接触介质表面;②枪头的点样量需保持一致。该指标对于杂交信号的分析起到至关重要的影响作用,目前已有多家公司生产、销售相应的设备。

探针点样的方式分为两种:①接触式点样,即针式打印。点样针直接与固相支持物表面接触,将DNA样品留在固相支持物上。其优点是探针密度高,通常每平方厘米可打印2500个探针;缺点是定量准确性及重现性不好,打印针易堵塞且使用寿casewhen命有限。②非接触式点样,即喷墨打印。它是以压电原理将DNA样品通过毛细管直接喷至固相支持物表面。喷印法的优点是定量准确,重现性好,使用寿命长;缺点是喷印的斑点大,因此探针密度低,通常每平方厘米只有400个点。

二、待检测样品的制备

生物样品往往是非常复杂的生物分子混合体,除少数特殊样品外,一般不能直接与芯片反应,必须将样品进行生物处理。根据样品来源、基因含量、检测方法和分析目的不同,采用的基因分离、扩增及标记方法各异。

一般来讲,如果实验的目的是为了检测基因组或者染色体上的突变,则往往涉及样品基因组DNA的制备及纯化、PCR、标记等步骤。如果是为了进行基因的表达分析,则通常涉及mRNA的制备及纯化、cDNA的合成、体外转录或PCR、标记等步骤。

从血液或活组织中获取DNA/mRNA样品时,要注意保持样品的稳定。尤其对于RNA来说,一旦生物样品被收集分离,它的RNA会立刻变得非常不稳定,极易被降解。由于特异及非特异的RNA降解,或者由于应激反应产生新的RNA都会引起RNA状态的改变。因此,采样后立即稳定样品里的RNA以保存当时RNA的表达状态,是精确/定量研究基因表达分析的重要前提。为了达到这个目的,往往需要采样后立即抽提RNA,或者将液氮或干冰带到采样现场,将样品立刻冻存后运回实验室低温保存。

待检测DNA或RNA在标记以前一般需要进行目的基因片段的扩增以提高灵敏度。一般采用固相PCR系统,即在靶DNA上设计一对双向引物,将其固化在丙烯酰胺薄膜上,加入模板及PCR试剂,在固相表面进行PCR反应,扩增时所合成的DNA会在引物间形成桥,从而避免了非特异扩增的竞争。

为了获得基因的杂交信号必须对目的基因进行标记。标记物有荧光色素、生物素、地高辛、放射性核素等。标记物一般伴随着体外转录、PCR、反转录等过程引入到被检测样品中。常用的荧光染料有Cy3、Cy5、FITC、fluorescein、Texas red、rhodamine、bodipy、Alexa dye等,如果同时使用双色或多色荧光标记,则可以在一张芯片上同时检测2个或多个样品。

三、分子杂交

待测样品经扩增、标记等处理后,即可与DNA芯片上的探针阵列进行分子杂交。芯片上的杂交与常规经典的分子杂交过程不同:常规经典的分子杂交过程,将待测样品固定于滤膜上,与标记探针在一定杂交液及温度下进行杂交,一般需要较长时间才能完成分子杂交过程,且每次只能检测为数不多的一个到几个探针。而DNA芯片则将已知序列的DNA探针显微固化于支持物的表面,待检测样品进行标记并与探针进行杂交。这种方式不仅使得检测过程平行化,可以同时检测成百上千的基因序列,而且由于集成的显微化,使得杂交所需的探针及待测样品的量大为减少,杂交时间明显缩短,分子杂交过程一般可在30分钟内完成。

分子杂交要根据探针的类型、长度以及研究目的来选择优化杂交条件。例如用于基因表达检测,杂交时需要高盐浓度、高样品浓度、低温和长时间(往往要求过夜),严谨性要求比较低,这有利于增加低拷贝基因检测的灵敏度;若用于突变检测,要鉴别出单碱基错配,则需要在短时间内(几小时)、低盐、高温条件下高严谨性casewhen杂交。多态性分析或者基因测序时,每个核苷酸或突变位都必须检测出来,通常设计出一套4种寡聚核酸探针,在靶序列上跨越每个位点,只在中央位点碱基有所不同,根据每套探针在某一特点位点的杂交严谨程度,即可测定出该碱基的种类。

基因芯片的杂交过程是在芯片杂交炉里进行的。杂交后的芯片要经过严谨条件下的洗涤,洗去未杂交的残留物。洗涤的过程可以通过洗涤工作站全自动地控制洗涤试剂的用量、洗涤的时间、洗涤的温度。洗涤完成后,便可以对芯片进行扫描了。

四、图像采集和软件分析

当生物芯片上的探针和标记样品杂交完毕后,就需要对杂交结果进行图像的采集与分析。一般膜芯片的杂交都用放射性核素32P、33P做标记,其信号的检测需通过磷感屏成像系统来完成。而对于用荧光标记的玻璃芯片杂交后的检测,则需要用专门的荧光芯片扫描仪。

磷感屏成像系统(cyclone storage phosphor system)的工作原理如下:放射性核素标记的杂交结果在磷屏上曝光,曝光过程32P等放射性核素核衰变同时发出β射线,首先激发磷屏上分子,使磷屏吸收能量分子发生氧化反应,以高能氧化态形式储存在磷屏分子中。激光扫描磷屏,对于激发态高能氧化态磷屏分子发生还原反应,即从激发态回到基态时多余的能量以光子形式释放,从而被光电倍增管(photomultiplier tube,PMT)捕获进行光电转换,磷屏上分子回到还原态。计算机接受电信号,经处理形成屏幕图像,并进一步分析和定量。

荧光芯片扫描仪根据原理不同大致分为两类:①激光共聚焦显微镜的原理,是基于PMT的检测系统;②电荷耦合装置(charge-coupled devices,CCD)摄像原理检测光子。CCD一次可成像很大面积的区域,而以PMT为基础的荧光扫描仪则是以单束固定波长的激光来扫描,因此或者需要激光头,或者需要目的芯片的机械运动来使激光扫到整个面积,这样就需要耗费较多的时间来扫描。

通过上述方法获得的图像的数据分析,简单来说就是对芯片上高密度杂交点阵图像处理并从中提取杂交点的荧光强度信号进行定量分析,通过有效数据的筛选和相关基因表达谱的聚类,最终整合杂交点的生物学信息。

数据分析主要包括图像分析(biodiscovery imagene 4.0/quantarray分析软件)、标准化处理(normalization)、Ratio值分析、基因聚类分析(gene clustering)。

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