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蛋白质的分离与纯化_分子生物学技术

时间:2020-02-09百科知识
蛋白质的分离与纯化_分子生物学技术

第二节 蛋白质的分离与纯化

蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在,每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务,到目前为止,还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来,但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序,采取几种方法联合使用来获取高纯度的产品。

蛋白质的分离纯化方法很多,主要有根据蛋白质溶解度不同的分离方法,如蛋白质的盐析、等电点沉淀法、低温有机溶剂沉淀法等;根据蛋白质带电性质进行分离的方法,如电泳法、离子交换层析法(IEC);根据不同配体特异性的分离方法,如亲和层析法;根据蛋白质分子大小差别的分离方法,如透析与超滤、凝胶过滤层析法(GFC)等。其中透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开;超滤法是利用高压力或离心力,使水和其他小的溶质分子通过半透膜,而蛋白质留在膜上,可选择不同孔径的滤膜截留不同相对分子质量的蛋白质。

上述分离方法中的凝胶过滤层析法、离子交换层析法、亲和层析法均属于层析法。层析法是利用待分析样品各组分物理化学性质的差异,如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力和分配系数等,使各组分以不同程度分布在互不相溶的两相,即固定相和流动相中,并以不同的速度移动,最终彼此分开。固定相可以是固体、液体、或一种固体和一种液体的混合物,而流动相可以是一种液体或一种气体。

近年来,随着生物技术的发展,蛋白质分离纯化的技术也有不少发展,比如浊点萃取法(CPE)、置换色谱法、双水相萃取法等。

一、凝胶过滤层析法(GFC)

凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质,不论是天然的还是人工合成的凝胶,内部都具有很细微的多孔网状结构。当蛋白质样品加载于凝胶柱后,不同相对分子质量大小、不同形状的蛋白质在网孔状结构的凝胶中行进的速度不一,较大的分子不能通过孔道扩散进入凝胶珠体内部,而与流动相一起最先流出层析柱;小分子蛋白可完全渗入凝胶内部,流速最慢;中等分子的蛋白将在固定相和流动相中产生不同的分配。根据分子筛效应,通过收集不同组分的分离液,可将不同相对分子质量大小的蛋白质分离开来。

目前市场上有售的凝胶过滤介质有:葡聚糖凝胶,如Sephadex;聚丙烯酰胺凝胶,如Bio-Gel P;琼脂糖凝胶,如Sepharose、Superose、Bio-Gel A;以及由琼脂糖和葡聚糖组成的复合凝胶。不同的凝胶均有不同孔径的系列产品,可以根据欲分离样品的相对分子质量大小选择合适的凝胶。一般相对分子质量较小的生物分子,选用葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶,以前者应用更为普遍;大相对分子质量的生物分子选用琼脂糖凝胶;中等相对分子质量的,则几种均可选择,但因琼脂糖比其他两种机械强度好,故倾向于采用琼脂糖凝胶的比较多。有时候并不知道样品的相对分子质量范围,此时只能先试用某种凝胶,再考虑是否选择分离效果更好的。

二、离子交换层析法(IEC)

利用所分离物质的阴、阳离子和相对应的离子交换剂之间的静电结合,根据物质酸碱性、极性等差异,通过离子间的吸附和脱吸附而将电解质各组分分开。由于电荷不同的各种物质对离子交换剂有不同的亲和力,通过改变洗脱液离子强度和pH,控制这种亲和力,可使这些物质按亲和力大小的不同按顺序依次洗脱。常用的离子交换剂有:离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖、离子交换琼脂糖凝胶等。

生物大分子和离子交换剂之间的相互作用主要是静电作用,导致介质表面的可交换离子与带相同电荷的蛋白质分子发生交换。离子交换剂分为阴离子交换剂和阳离子交换剂两大类。阴离子交换剂本身带碱性基团,在其pK以下荷正电,如果蛋白质分子在高于其等电点的pH范围内稳定,带负电荷,则可与阴离子交换剂结合;阳离子交换剂本身带酸性基团,在其pK以上荷负电,如果蛋白质分子在低于其等电点的pH范围内稳定,带正电荷,则可与阳离子交换剂结合。

三、亲和层析法(AC)

亲和层析法是在一种特制的具有专一吸附力的吸附剂上所进行的层析,是利用生物大分子和配基可逆亲和结合的原理而达到不同组分分离的目的。比如酶与底物或抑制剂、抗原与抗体、激素与其受体等之间的可逆结合。亲和层析是蛋白质分离纯化的一种重要的方法,具有很高的选择和分离性能以及较大的载量。只需要一步处理即可使某种待分离的蛋白质从复杂的蛋白质混合物中分离出来,达到千倍以上的纯化,并保持较高的活性。目前亲和层析技术被广泛地应用在蛋白质研究和制备领域,是分离纯化以及分析生物大分子尤其是蛋白质的有力工具。

亲和层析法中,配基的选择是实验成败的关键。合适的配基在一定条件下应能和欲分离的蛋白质专一性结合,亲和力越大越好;一定条件下又要能与已结合的蛋白质解离,并且不破坏蛋白质的生物活性。由于不同的蛋白质选择的配基不一样,所以不同的蛋白质分离时需要制备吸附有不同配基的层析柱,导致亲和层析法的成本比较贵,但特异性好。

亲和层析技术的一般步骤是:把待纯化的某种蛋白质的特异配体,通过化学反应共价连接到载体表面的功能基上构成配基。载体性能方面要允许蛋白质自由通过。当含有目的蛋白的混合样品加到该配基上时,目的蛋白即和其特异性的配体结合而吸附在配基表面,而其他杂蛋白则被洗出。被特异地结合在配基上的目的蛋白质可用自由配体分子或通过改变缓冲液的条件使之解吸附,并进一步收集。

(高红阳)

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