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基因表达产物的检测_分子生物学技术

时间:2020-02-09百科知识联系我们
基因表达产物的检测_分子生物学技术

第七节 基因表达产物的检测

随着基因工程技术的日趋成熟,基因表达产物的种类越来越多。根据表达产物应用对象的不同,相应的分析、鉴定和纯化方法也有不同的要求。由于大多数蛋白质本身就是一种优良的抗原或半抗原,因此目前常用免疫学技术测定可溶性蛋白质

经各种方法获得蛋白后,可用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)以及一些免疫学方法如Western印迹、ELISA、固相放射免疫测定、免疫沉淀反应、放射免疫沉淀法及免疫荧光抗体技术等检测宿主细胞中表达的外源蛋白,也可直接检测表达产物的生物学活性。应强调的是,进行SDS-PAGE及Western印迹所测样品并非一定是可溶性蛋白质,也可以是细胞培养液离心后所得的细胞沉淀,而用其他免疫学方法测定蛋白质一般要求样品为可溶性。

一、聚丙烯酰胺凝胶电泳

PAGE分离蛋白质的原理是以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物,采用电泳基质的不连续体系(即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性),使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带,然后再进行电泳分离。

在蛋白质溶液中加入SDS和还原剂(如DTT、βME)后,还原剂使蛋白质分子中的二硫键还原,SDS把蛋白质的氢键、疏水键打开,并结合到蛋白质分子上,形成蛋白质-SDS复合物,在足够量的SDS作用下,使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷,它的量大大超过了蛋白质分子本身的电荷量,因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。这样的蛋白质-SDS复合物,在凝胶电泳中的迁移率只与蛋白质分子的大小相关,因而可根据蛋白质的相对分子质量,来筛选阳性表达的重组体。阳性表达的重组体应出现一条与预计目的蛋白的相对分子质量相同的蛋白带,而对照空载体没有。这种方法在目的蛋白表达水平较高时可采用。目的蛋白表达水平较低时,有可能看不到阳性蛋白条带,此时应用其他更特异的方法检测,如Western印迹分析、ELISA等。

二、Western印迹分析

Western印迹分析是将蛋白质转移到化学合成膜的支撑物上,然后以特定的亲和反应、免疫反应或结合反应以及显色系统分析此印迹。其过程大致为:经SDS-PAGE后的样品转移并固定在硝酸纤维素膜等固相膜上,然后将印有蛋白条带的膜依次与针对目的蛋白的特异抗体、酶标记第二抗体作用后,加入能形成不溶性显色物的酶反应底物,使蛋白条带染色。Western印迹检测蛋白质特异性和敏感性高,可检测出纳克水平的蛋白质,因而在实验室中广泛采用。

三、酶联免疫吸附测定(ELISA)

ELISA是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫技术。利用抗原或抗体可以和酶结合,所形成的复合物既保留了免疫学活性,又保留了酶活性这一特点,把待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。洗涤后,加入酶反应的底物,根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。该法既可用于测定抗原,也可用于测定抗体,可检测出低至纳克水平的蛋白质。ELISA既具有抗原抗体反应的特异性,又有酶促反应的生物放大作用,因此可作为基因表达产物的定性、定量测定方法。该法可分为直接法、间接法、夹心法和竞争法

四、固相放射免疫测定

固相放射免疫测定的原理基本上与ELISA相同,主要区别在于用放射性核素标记抗原或抗体,目前常用的放射性核素是125I。各种类型的ELISA测定方法同样适用于固相放射免疫测定,但固相放射免疫测定的敏感度高于ELISA,可检出低于1pg的目的蛋白。因此,对于分析极微量的蛋白质十分有用。

五、免疫沉淀反应

免疫沉淀反应是在可溶性抗原与特异抗体结合的基础上建立的,实验室中常用到的是凝胶内沉淀反应,即利用可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散,形成浓度梯度,在抗原抗体浓度比例适当的位置形成可见的沉淀线或沉淀环。这种方法可检测出每毫升中微克水平的蛋白质。根据抗原和抗体反应的方式,分为单向扩散试验和双向扩散试验。

六、放射免疫沉淀法

是依据抗原抗体发生免疫沉淀反应建立的。其显著特点是用放射性核素标记表达产物,因而使检测的灵敏度大大提高,可检出低至100pg的蛋白质,应用于蛋白质混合物中目的蛋白的定性与定量,对于表达水平较低的蛋白质的检出尤为适用。(www.anred.net.cn)

七、表达产物的生物学活性检测

不同蛋白质的生物学活性不尽相同,应根据具体蛋白进行测定。如IL-2能促使T细胞的生长和增殖,可用IL-2依赖的CTL细胞检测IL-2的活性。又如干扰素能刺激某些指示细胞(如人羊膜上皮细胞Wish株、人喉癌细胞株Hep-2等)产生抗病毒蛋白,从而使细胞免受某些病毒的攻击,可根据待测样品不同稀释度的保护能力,计算出干扰素生物学活性单位。

(王松梅)

参考文献

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